Chromatographie

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Dernière modification de cette page le 19 janvier 2016
Anglais : chromatography
Espagnol : cromatografía
Étymologie : grec χρῶμα chrôma couleur et γράφω gráphô graver, écrire
n. f. Terme générique utilisé pour désigner un ensemble de méthodes physiques de séparation dans lesquelles des composants d’un mélange sont séparés par distribution entre deux phases, l’une stationnaire et l’autre mobile qui percole à travers la précédente. Les solutés à séparer participent à une suite continue d’un nombre considérable d’équilibres de distribution entre ces deux phases. Il en résulte que chaque soluté, suivant son coefficient de distribution entre ces deux phases, finit par migrer à une vitesse qui lui est propre. L’appareillage comprend schématiquement d’amont en aval : un dispositif d’introduction de l’échantillon, la phase stationnaire immobilisée à l’intérieur ou à la surface d’un support pouvant avoir la forme d’un tube dit alors colonne chromatographique, un détecteur pour repérer les solutés séparés. Il comprend également un dispositif assurant la percolation à débit régulé de la phase mobile liquide (chromatographie liquide) ou gazeuse (chromatographie en phase gazeuse) ainsi que divers programmes la concernant (gradients de composition) ou relatifs à ses échanges avec la phase fixe (gradients de température).

Les théories de la chromatographie sont de deux types, la théorie des plateaux et la théorie cinétique. L’immense succès des méthodes chromatographiques est à attribuer au fait qu’elles permettent dans des conditions judicieusement choisies aussi bien de séparer, même à l’échelle préparative, que d’identifier et de doser les divers constituants d’un mélange. La classification des méthodes chromatographiques est fondée sur :


1- L'immobilisation de la phase stationnaire
  1. Colonne remplie (anglais packed chromatography, espagnol cromatogafia en columna) lorsque la phase stationnaire est constituée de particules qui remplissent le volume interne de la colonne.
  2. Colonne tubulaire ouverte (anglais open tubular chromatography, espagnol sobre cromatografía en columna abierta) lorsque la phase stationnaire est constituée, soit d’un film de 0,5 à 1 µm déposé sur les parois d’un tube capillaire très long (10 à 50 m parfois plus) de très faible diamètre interne (de l’ordre de 0,1à 0,5 mm), soit de fines particules poreuses adhérant à la paroi, imprégnées de phase stationnaire par exemple chromatographie capillaire.
  3. Planaire (anglais planar chromatography, espagnol cromatografía plana). L’élution se fait par développement sur une surface plane. Le plus souvent, la migration de la phase mobile a lieu à la pression atmosphérique par gravité ou sous l’effet d’une force centrifuge (descendante, circulaire) ou par capillarité (ascendante). Certains procédés actuellement en plein essor, forcent ce mouvement en opérant sous pression. Ce développement peut être uni ou bi-dimensionnel lorsque tout ou partie des fractions issues d’une première séparation (1ère dimension) sont soumises, selon les mêmes conditions, à une seconde séparation (2ème dimension) ou à un principe de séparation différent de la première (chromatographie bidimensionnelle).
  4. Couche mince, CCM (anglais thin layer chromatography , TLC espagnol cromatografía en capa fina, CCF). Type de chromatographie planaire dans lequel la phase stationnaire (gel de silice, résines échangeuses d’ions…) déposée en un film de faible épaisseur (0,1 à 2,5 mm) adhère sur un support rigide (verre) ou souple (aluminium ou plastique).
  5. Papier (anglais paper chromatography esp cromatografía en papel. Type de chromatographie planaire dans lequel une feuille de papier filtre (cellulose) immobilise par capillarité la phase stationnaire

.


2- La méthodologie de migration.
  1. Chromatographie de développement (anglais development chromatography, espagnol cromatografía de desarrollo). Type de chromatographie dans laquelle une grande quantité de phase stationnaire est parcourue par la phase mobile (solvants purs ou mélanges de solvants purs). Lorsque le temps de migration de la phase mobile est fixé, les solutés, ayant migré chacun à une distance différente puisqu’à une vitesse différente, se trouvent séparés. Procédé essentiellement mis en œuvre actuellement en chromatographie planaire à la fin de laquelle les solutés séparés ne sont en général pas récupérés.
  2. Chromatographie d’élution (anglais elution chromatography, espagnol cromatografía de elución). S’effectue sur une colonne dans laquelle est disposée la phase stationnaire. La distance de migration est fixée par la longueur de la colonne, les temps de sortie (dits temps de rétention) différant pour chacun des solutés séparés, détectés et éventuellement récupérés à sa sortie.
  3. Chromatographie frontale (anglais frontal chromatography, espagnol cromatografía frontal) dans laquelle, par un apport continu du mélange à résoudre, on sature la phase stationnaire. Le soluté qui possède la moins grande affinité pour cette dernière finit par être déplacé par ceux présents dans le mélange à résoudre qui en possèdent une plus élevée.
  4. Chromatographie par déplacement (anglais displacement chromatography, espagnol chromatografía de desplazamiento). Variante du cas précédent. La phase mobile contient un soluté possédant une plus grande affinité que ceux présents dans le mélange.


3- La nature des phases
  1. Phase gazeuse, CPG (anglais gas-liquid chromatography, GLC et gaz-solid chromatography, GSC, espagnol cromatografía gas-liquido). Chromatographie dont la phase mobile est un gaz. Très utilisée, elle est la méthode la plus puissante pour résoudre un mélange gazeux ou volatilisable.
  2. Phase liquide, CL (anglais liquid chromatography, espagnol cromatografía líquida). La phase mobile est un liquide. Elle s’effectue, le plus souvent, sur colonne, mais aussi sur support (Cf chromatographie planaire) et regroupe les chromatographies liquide-liquide (par exemple eau phase stationnaire imbibant une feuille de cellulose - chromatographie sur papier - ou eau ou autre solvant retenu sur particules de silice ou substances organiques greffées) et les chromatographies liquide-solide (par exemple gels, résines, alumine). La chromatographie liquide sur colonne par simple percolation, à pression atmosphérique, est tombée largement en désuétude du fait de sa faible vitesse d’élution. Elle a été remplacée par une forme moderne dans laquelle le débit est maîtrisé par un système de pompes. Les phases stationnaires de granulométrie fine et homogène (3-10 µm) nécessitent d’imposer une pression d’entrée de colonne pouvant aller jusque 400 bars environ. Forme moderne des chromatographies liquides sur colonne, cette chromatographie, à débit imposé, est plus rapide et plus efficace que la chromatographie sur colonne où l’écoulement de la phase mobile s’effectue par percolation. Initialement appelée chromatographie à haute pression puis à haute performance (CLHP), la chromatographie à débit imposée est actuellement désignée sous le simple terme de chromatographie liquide (CL). L’utilisation de colonnes, remplies de particules de plus faible diamètre (inférieur à 2 µm), permet d’obtenir une meilleure efficacité et une très grande rapidité mais nécessite des pressions d’entrée plus importantes (1300 bars). Elle est, pour cela, appelée chromatographie liquide à ultra haute pression (anglais Ultra High Pressure Liquid Chromatograpy, UHPLC, espagnol Cromatografía líquida de alta resolución,CLAR).
  3. Phase liquide à polarité de phases normale (anglais normal phase chromatography, espagnol cromatografía en fase normal). La plus ancienne fait appel à une phase stationnaire polaire et une phase mobile moins polaire, voire apolaire.
  4. Phase liquide à polarité de phases inversée (anglais reversed-phase chromatography, espagnol cromatografía de fase reversa), technique plus récente mettant en œuvre une phase stationnaire apolaire et une phase mobile plus polaire.
  5. Phase liquide chirale (anglais chiral chromatography, espagnol cromatografía quiral) dans laquelle la phase stationnaire comporte des groupements énantiosélectifs ou bien la phase mobile contient un additif chiral, par exemple séparation d’énantiomères à partir d’un racémique par chromatographie chirale, opération exigée par les autorités de santé, souvent délicate à réaliser par d’autres voies.
  6. Phase supercritique (anglais supercritical-fluid chromatography, (SFC), espagnol cromatografía de fluidos supercríticos). Type de chromatographie dans lequel la phase mobile est un fluide (par exemple dioxyde d’azote) porté à une température et à une pression légèrement supérieures aux valeurs critiques.


4- Le phénomène physicochimique de séparation chromatographique
  1. Chromatographie liquide à contre-courant (anglais countercurrent chromatography, espagnol cromatografía en contracorriente). Utilise deux phases liquides immiscibles sans intervention d’un support solide.
  2. Chromatographie d’adsorption (anglais adsorption chromatography, espagnol cromatografía de adsorción) où les solutés se partagent entre une phase stationnaire solide sur laquelle ils sont plus ou moins adsorbés et la phase mobile liquide.
  3. Chromatographie d’affinité (anglais affinity chromatography, espagnol cromatografía de afinidad). Selon l’IUPAC, variante chromatographique dont le mécanisme de séparation est fondé sur une interaction biologique unique analyte-ligand lui conférant sa spécificité
  4. Chromatographie de partage (anglais partition chromatography, espagnol cromatografía de partición). Fondée sur les différences entre les coefficients de partage différents des solutés entre le solvant utilisé comme phase mobile et la phase stationnaire non miscible, immobilisée sur un support inerte. Cf chromatographies liquides, en phase supercritique, en phase gazeuse.
  5. Chromatographie d’exclusion stérique (synonyme d’exclusion-diffusion, anglais size-exclusion chromatography, espagnol cromatografía de exclusión por tamaños) où la phase stationnaire est un gel ou un réseau macromoléculaire exerçant un véritable effet de tamis vis-à-vis de grosses molécules qui, moins retenues, sont éluées les plus rapidement.
  6. Chromatographie de filtration sur gel (anglais gel filtration chromatography, espagnol cromatografía de filtración en gel) où la phase mobile est aqueuse.
  7. Chromatographie de perméation sur gel (anglais gel permeation chromatography, espagnol cromatografía de permeación en gel) où la phase mobile est de nature organique.
  8. Chromatographie d’interactions hydrophiles (anglais Hydrophilic Interactions Liquid Chromatography (HILIC), espagnol cromatografía de interacción hidrofílica). Chromatographie de partage utilisant des phases mobiles riches en eau, en association avec des phases stationnaires polaires . Particulièrement adaptée à la séparation de composés polaires.
  9. Chromatographie d’interactions hydrophobes (anglais Hydrophobic Interactions Chromatography, espagnol cromatografía de interacción hidrofóbica). Permet la séparation des protéines sur la base d’interactions hydrophobes entre la phase stationnaire et des régions apolaires de la surface des protéines. La rétention est favorisée par des concentrations élevées, en sels, dans la phase mobile cependant que l’élution est favorisée par des concentrations en sels décroissantes.
  10. Chromatographie par échange d’ions (anglais Ion-exchange Chromatography ou Ion Chromatography, espagnol cromatografía de intercambio iónico). Type de chromatographie dans lequel la phase stationnaire a des propriétés d’échangeurs d’ions.
  11. Chromatographie par échange de ligands (anglais ligand exchange chromatography, espagnol cromatografía de intercambio de ligandos) dans laquelle la phase stationnaire incorpore un métal, généralement un métal de transition, qui permet de retenir des solutés (ligands) présentant des groupements à caractère électro-donneur.
  12. Chromatographie par formation de paires d’ions (anglais ion-pair chromatography, espagnol cromatografía de formación de pares iónicos) dans laquelle la phase stationnaire contient un ion charge opposée à ceux que l’on veut séparer. Ces derniers donnent ensuite avec le précédent des paires d’ions dont les caractéristiques d’extraction diffèrent .


5- l'obectif envisagé
  1. Chromatographie analytique (anglais analytical chromatography, espagnol cromatografía analítica), où les constituants d’un mélange sont séparés dans le but d’identifier et/ou de quantifier les composés d’intérêt en quantités inférieures au mg, la détection constituant la dernière étape instrumentale. Selon le diamètre interne (dc) de la colonne analytique, celle-ci est qualifiée de chromatographie conventionnelle (dc = 4,6 mm), sur colonne de petit diamètre (dc = 2,1 mm), microchromatographie (dc = 1 mm), chromatographie capillaire (dc = 320 µm) et nanochromatographie (dc = <100 µm).
  2. Chromatographie préparative (anglais preparative-scale chromatography, espagnol cromatografía preparativa). Fait appel à une colonne de diamètre plus important (dc = 8 mm), dans le but de purifier et collecter les composés d’intérêt en quantités inférieures au gramme, la dernière étape est la séparation du solvant des solutés et la récupération de ceux-ci.

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