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Électrophorèse

De acadpharm
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Anglais : electrophoresis
Espagnol : electroforesis
Étymologie : grec ἤλεκτρον ếlektron ambre jaune et φορός phorós qui porte en avant, qui pousse
n. f. Méthode de séparation et d’identification et, dans certains cas, méthode d’analyse quantitative, basée sur la migration d’ions sous l’influence d’un champ électrique. On distingue l’électrophorèse capillaire et l’électrophorèse classique sur support. Quel que soit le type, les ions et espèces chargées, plus complexes, présentent une vitesse v dépendant de la valeur du champ électrique E qui, lorsque celui-ci intervient seul, lui est proportionnelle : v = µe E (relation exprimée en modules) où µe est la mobilité électrophorétique de l’espèce, fonction du rayon hydrodynamique de la masse et de la charge de l’espèce.
Le pH du milieu joue un rôle très important, car il conditionne souvent la charge des espèces par ionisation acide – base.


Électrophorèse capillaire

Anglais : capillary electrophoresis
Espagnol : electroforesis capilar
Résulte de la migration différentielle, sous l’effet d’un champ électrique, des espèces à séparer dans un capillaire étroit rempli d’une solution d'électrolytes. Les espèces chargées migrent sous l’influence directe du champ (migration électrophorétique) et aussi par électroendosmose qui affecte aussi les espèces neutres (migration d’électroendosmose). Les espèces chargées ont donc une mobilité totale supérieure à celle d’électroendosmose si leur charge est positive, inférieure si elle est négative, cette dernière l’emportant sur la précédente.
L’appareillage est constitué d’amont en aval :
1- d'un injecteur placé près de l’anode puisque le flux d’électroendosmose dominant est un flux d’ions positifs ;
2- d'un capillaire en silice fondue d’une longueur de 20 à 100 cm et d’un diamètre inférieur de 20 à 100 µm dont les extrémités trempent dans une solution d'électrolytes ;
3- d'un détecteur situé près de la cathode. La détection peut s’effectuer à travers le capillaire ou à l’aide d’une interface. Les détecteurs sont du même type que ceux décrits en chromatographie liquide (électrochimiques, par spectrophotométrie UV-visible, par fluorométrie, par spectrométrie de masse).
Les signaux enregistrés fournissent un électrophorégramme dont l’allure est très proche de celle des chromatogrammes. Plusieurs modalités de séparation sont possibles :
1- sur gel, le capillaire est rempli d’un gel de polyacrylamide pour ajouter aux mécanismes de séparation un effet de tamisage ;
2- en mode micellaire, un composé tensioactif est ajouté à la solution tamponnée qui remplit le capillaire pour faciliter la séparation des substances neutres ;
3- en zone libre, la composition du tampon et la valeur du champ électrique sont constants le long du capillaire.

Les avantages de l'électrophorèse capillaire sont liés au faible volume des tubes capillaires qui, très étroits et longs, permettent d’utiliser de fortes différences de potentiel nécessaires pour diminuer le temps d’analyse. La méthode est ainsi plus rapide que l’électrophorèse classique (de l’ordre de 5 à 20 minutes) et que la chromatographie. Elle est plus efficace que cette dernière, car son nombre de plateaux théoriques est plus élevé. Le faible volume d’échantillon injecté (de 1 à 10 µL), le fait que les séparations soient effectuées à température ambiante et son faible coût d’utilisation sont autant de points en faveur de la méthode. Les limites sont dues à son seuil de détection qui est plus élevée qu’en chromatographie et sa précision en matière de détermination quantitative est plus faible que celle atteinte en chromatographie.
Les applications sont nombreuses et couvrent de nombreux domaines. Par exemple, dans le domaine pharmaceutique, l’électrophorèse capillaire permet l’analyse d’impuretés et de produits de dégradation dans les matières premières, le dosage de composés pharmacologiquement actifs, le contrôle de la pureté optique. Dans le domaine de la biologie clinique, elle permet l’identification de nombreuses protéines, lipoprotéines, glycoprotéines, des acides nucléiques et même le dosage de médicaments dans le cadre de situations cliniques thérapeutiques et toxicologiques.



Électrophorèse classique

Anglais : classic electrophoresis
Espagnol : electroforesis clásica
Plusieurs modalités sont possibles :
1- Électrophorèse en veine liquide (ou électrophorèse de frontières) : la séparation des espèces est basée sur leur différence de mobilité. La solution de l’échantillon est placée dans un tube en U et est recouverte d’une solution tampon. Les électrodes sont placées dans le tube où l’on applique le champ électrique. Les différents constituants du mélange migrent pendant un temps t et une séparation complète ou partielle, en fonction de leur mobilité électrophorétique, est obtenue dans chacune des branches.
Première méthode électrophorétique décrite, elle a été mise au point par Tiselius.Technique Peu utilisée à l’heure actuelle.
2- Électrophorèse de zone : la migration des molécules s’effectue dans un support solide poreux imprégné d’une solution tampon. Il s’ensuit des mobilités plus faibles que celles obtenues en veine liquide. L’identification des échantillons se fait par évaluation de la distance parcourue sur le support et l’analyse quantitative par coloration des zones réalisée à l’aide d’un densitomètre.
Le papier est actuellement peu utilisé comme support, on lui préfère l’acétate de cellulose donnant lieu à moins de phénomènes d’adsorption et d’électroendosmose ainsi que des gels divers comme celui de polyacrylamide en raison de sa grande résistance mécanique et de la reproductibilité de sa porosité.
3- Électrophorèse par isofocalisation (ou électrofocalisation), variante de l’électrophorèse sur gel : les molécules amphotères se déplacent dans un champ électrique et dans un gradient de pH jusqu'à la zone correspondant à leur point isoélectrique. Le gradient de pH est réalisé en imprégnant le gel avec un mélange de substances amphotères de points isoélectriques différents. Lorsque l’on applique la différence de potentiel, les différents ampholytes se rangent dans l’ordre de leur point isoélectrique.
Technique qui conduit à de très hautes résolutions.